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            用光檢測,用心計量—實時定量PCR儀熒光檢測系統(tǒng)
          
      
          
      
            發(fā)布時間：2019-09-12 閱讀：150次 
          
      
		  
      
            
		  
      
          
      
                熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR反應(yīng)過程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。這一技術(shù)特異性強(qiáng)，自動化程度高，且有效地解決了PCR污染。因此，實時熒光定量PCR儀逐步取代普通PCR儀在臨床檢驗、檢驗檢疫、法醫(yī)鑒定、疾病控制、體外診斷試劑制造和研發(fā)、生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)等領(lǐng)域得到了為廣泛的應(yīng)用。
      
    熒光定量PCR儀在普通PCR儀的技術(shù)上增加了熒光激發(fā)裝置和檢測系統(tǒng)，包含激發(fā)光光源，濾光片，鏡頭和熒光檢測器等。溫度與光學(xué)系統(tǒng)共同對熒光定量PCR儀的性能起到?jīng)Q定性控制作用，共同決定終實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，對PCR儀的校準(zhǔn)需求也逐步從單純的溫場校準(zhǔn)轉(zhuǎn)向溫度加熒光的復(fù)合參數(shù)校準(zhǔn)。
      
    影響熒光定量PCR儀熒光信號量的主要因素包含化學(xué)試劑、PCR儀模塊的溫度因數(shù)、PCR儀頂蓋溫度因數(shù)、鏡頭，反光鏡和光路通道、熒光接收器的敏感度、PCR儀機(jī)械組成部分、熒光信號處理軟件的閾值設(shè)定，如基線，基線設(shè)定，S/N比例探測等。
      
    但是醫(yī)院使用生物試劑測試盤這種檢測方法和采用已知濃度的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對樣本線性誤差進(jìn)行校準(zhǔn)的方法都屬于化學(xué)方法，這種用化學(xué)方法來對物理現(xiàn)象進(jìn)行校準(zhǔn)的方法，嚴(yán)格上將存在缺陷，僅能夠針對孔與孔間的組合線性進(jìn)行測量，所得結(jié)果僅能代表PCR儀孔與孔間的平均結(jié)果，不能代表單孔的線性，無法真實反映儀器的性能。且無法溯源到任何公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，并無法說明熒光定量PCR儀的溫度和熒光對定量PCR結(jié)果的聯(lián)系和影響，誤差來源等。
      
    加科學(xué)的方法應(yīng)該采用可溯源物理手段同時對熒光定量PCR儀的溫度部分和光學(xué)部分進(jìn)行校準(zhǔn)，并分析二者之間的聯(lián)系。
      
    為了滿足客戶需求，引入了Cyclertest 3D optical 定量PCR儀熒光校準(zhǔn)系統(tǒng)。系統(tǒng)在原有的PCR儀溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)基礎(chǔ)上運(yùn)用可溯源光譜理論，使熒光探頭產(chǎn)生不同強(qiáng)度的熒光，將溫度和熒光檢測相結(jié)合，模擬熒光定量PCR儀試驗，不僅可以對溫度模塊、上蓋溫度進(jìn)行檢測，還能同時對熒光系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并分析而二者的相關(guān)性。
      
    溫度部分可以對PCR儀的溫度度、空間溫差、實時升溫速率、實時降溫速率、溫度過沖、溫度持續(xù)時間、上蓋溫度進(jìn)行校準(zhǔn)。熒光部分不僅可以避免光譜的漂移，用物理手段對熒光系統(tǒng)的線性進(jìn)行檢測，地解決了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)化學(xué)手段無法測量單孔線性的問題。還可以對熒光定量PCR儀的Cq（Ct）相差值，度，熒光飽和值，熒光線性，熔解曲線度及一致性，熔解溫度的比例關(guān)系及線性靈敏度等進(jìn)行檢測。
      
    Cq（Ct）值直接關(guān)系到熒光定量PCR儀的定量準(zhǔn)確度，并可用來判斷PCR儀的孔間一致性。
      
    通過對熒光強(qiáng)度的線性遞減過程進(jìn)行控制，可以對熒光單孔的線性和線性靈敏度進(jìn)行檢測。
      
    熔解曲線可反應(yīng)PCR擴(kuò)增過程中隨著溫度升高DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的降解程度，隨著反應(yīng)中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號降低，用熒光信號改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度（Tm值）上有一特征峰，利用不同熔解溫度對應(yīng)的特征峰的不同可將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物分開。熔解曲線度及一致性可判斷熒光檢測系統(tǒng)是否存在光路通道差異，熒光接收差異和熒光檢測靈敏度差異等。熔解溫度比例可判斷漂移產(chǎn)生的原因來源是光學(xué)系統(tǒng)還是溫度系統(tǒng)。
      
    峰值間相差值與孔間溫度差異一直，樣品為同一樣品，引起熔解曲線漂移的原因是溫度孔間溫差。
      
    近幾年，實時定量PCR儀已經(jīng)逐步取代普通PCR儀，基因檢測由此迎來了新的時代，這對計量人而言，是挑戰(zhàn)，但是機(jī)遇，技術(shù)從不止步，計量人也從不停歇。
      

      

      
	
      

      

      
	
      

      

      
	
      

      

      
	
      

      

      

      

      
	
      

      

      
	
      

      

      
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